2013執(zhí)業(yè)藥師藥物分析知識點(diǎn)：酶的純化

　　執(zhí)業(yè)藥師藥物分析知識點(diǎn)：酶的純化

　　酶是蛋白質(zhì)，因此凡用于蛋白質(zhì)的純化手段均適用于酶的純化，如鹽析法、聚乙二醇沉淀法、有機(jī)浴劑分級沉淀法、等電點(diǎn)法、選擇性沉淀法、各種柱層析法(吸附層析、離子交換層析、凝膠過濾)、各種電泳法及親和層析等。不同之處是酶的純化過程尚需選用迅速簡便的活力測定方法，以追蹤酶的去向。在選用酶的活力測定方法時(shí)，分析方法的迅速要比其精確度更為重要。如寧可要一個(gè)需時(shí)5min，準(zhǔn)確度為5%的方法;也不要一個(gè)需時(shí)30min，準(zhǔn)確度為0.5%的方法。在建立活力測定法之后，再根據(jù)各單元純化步驟及活力分布情況用列表形式表達(dá)，表的內(nèi)容包括：操作步驟、總體積、酶濃度(每毫升酶活力)、總活力、蛋白質(zhì)濃度mg/ml)、比活力(即純度、酶活力單位/毫克蛋白)、產(chǎn)率%(每步總活力除以第一步的總活力)和純化倍數(shù)(每步比活力除以第一步比活力)。

　　一個(gè)典型的酶純化過程常包括多個(gè)單元操作，各單元操作如何串聯(lián)，需靠實(shí)踐摸索。每經(jīng)過一個(gè)步驟一般可提高酶純度2一3倍，總純度可提高數(shù)千倍，而總產(chǎn)率常僅百分之幾或十幾。總的原則是選用最少的步驟而能取得最好的純化效果、因?yàn)樵黾硬襟E勢必增加酶的丟失。通常對于含鹽濃度高的粗提取液一般不宜采用吸附法而多用鹽析法;對于低離子強(qiáng)度的酶溶液則可用吸附法或離子交換法。交替使用不同分級沉淀法常比單獨(dú)重復(fù)同一類型方法更能奏效。所以常將吸附法、鹽折法和有機(jī)溶劑分級沉淀法串聯(lián)起來進(jìn)行純化。當(dāng)這些方法仍達(dá)不到要求時(shí)，還可以采用一些包括電泳、層析法在內(nèi)的其他類型純化方法。

　　當(dāng)酶達(dá)到一定純度時(shí)，便可以進(jìn)行結(jié)晶，結(jié)晶也是純化酶的有效手段之一。但應(yīng)注意的是藥用酶有些并不需要結(jié)晶。酶的第一次結(jié)晶純度有時(shí)仍低于50%。酶的結(jié)晶通�？梢栽谳^純的酶液中添加硫酸銨、氯化鈉等鹽達(dá)到一定飽和度，使酶慢慢結(jié)晶出來。此時(shí)必須控制溫度和pH值。鹽濃度要逐漸提高，添加速度要慢，才能得到較好的結(jié)晶。有時(shí)在低溫下，用丙酮、乙醇等有機(jī)溶劑進(jìn)行結(jié)晶。近年來采用平衡透析法，即將酶液裝人透析袋中，置于一定飽和度的鹽溶液中進(jìn)行透折，這種操作可以獲得大量結(jié)晶。