2013公衛(wèi)助理醫(yī)師輔導(dǎo)：氧化磷酸化偶聯(lián)部位的測(cè)定

　　確定氧化磷酸化偶聯(lián)部位通常用兩種方法。

　　(一)P/0值測(cè)定

　　P/0值指在氧化磷酸化過程中消耗一克原子氧所消耗的無機(jī)磷的克原子數(shù)，或者說消耗一克原子氧所生成的ATP的克分子數(shù)。P/0值實(shí)質(zhì)上指的是呼吸過程中磷酸化的效率。

　　測(cè)定P/0值的方法通常是在一密閉的容器中加入氧化的底物、ADP、Pi、氧飽和的緩沖液，再加入線粒體制劑時(shí)就會(huì)有氧化磷酸化進(jìn)行。反應(yīng)終了時(shí)測(cè)定O2消耗量(可用氧電極法)和Pi消耗量(或ATP生成量)就可以計(jì)算出P/0值了。在反應(yīng)系統(tǒng)中加入不同的底物，可測(cè)得各自的P/0值，結(jié)合我們所了解的呼吸鏈的傳遞順序，就可以分析出大致的偶聯(lián)部位了。

　　表6-3　離體線粒體的P/0比值

　　從上表可以看出P/0值為小數(shù)，由于線粒體的偶聯(lián)作用在離體條件下不能完全發(fā)揮，故可認(rèn)為實(shí)際的ATP生成數(shù)是他們所接近的正整數(shù)值。

　　比較表中的(1)和(2)，呼吸鏈傳遞的差異是在CoQ之間，兩者ATP的生成數(shù)相差1，所以這個(gè)ATP的生成部位一定在NAD→CoQ之間。

　　比較表中(2)和(3)，呼吸鏈傳遞的差異是在Cyt c之間，兩者ATP的生成數(shù)相差1，所以這個(gè)ATP的生成部位在CoQ→Cyt c之間。

　　比較表中(3)和(4)，生成的ATP數(shù)均為1，呼吸鏈傳遞的區(qū)別是在Cyt c→Cyt aa3，故Cytc→ aa3不存在偶聯(lián)部位，而在Cyt aa3→O2之間存在著一個(gè)偶聯(lián)部位。

　　(二)根據(jù)氧化還原電位計(jì)算電子傳遞釋放的能量是否能滿足ATP合成的需要

　　氧化還原反應(yīng)中釋放的自由能△G'O與反應(yīng)底物和產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位差值(△E'O)之間存在下述關(guān)系：△G'O=�瞡F△E'O

　　式中n為氧化還原反應(yīng)中電子轉(zhuǎn)移數(shù)目，F(xiàn)為法拉弟常數(shù)(23.062千卡/克分子·伏特，或96500庫(kù)侖/克分子)。

　　一克分子ATP水解生成ADP與Pi所釋放的能量為7.3千卡，凡氧化過程中釋放的能量大于7.3千，均有可能生成一克分子ATP，就是說可能存在有一個(gè)偶聯(lián)部位，根據(jù)上式計(jì)算，當(dāng)n=2時(shí)，△E'O=0.1583V時(shí)可釋放7.3千卡能量，所以反應(yīng)底物與生成物的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位的變化大于0.1583V的部位均可能存在著一個(gè)偶聯(lián)部位。

　　從圖6-11可以看出，在NAD→CoQ,Cyt b→Cyt c和Cyt aa3→O2處可能存在著偶聯(lián)部位。必須明確，這種計(jì)算的基礎(chǔ)是反應(yīng)處在熱力學(xué)平衡狀態(tài)，溫度為25℃，pH為7.0，反應(yīng)底物和產(chǎn)物的濃度均為1克分子，這種條件在體內(nèi)是不存在的。