2013年藥學(xué)類輔導(dǎo)：病毒核酸及抗原的直接檢出

　　(一)直接檢出病毒核酸

　　1.標(biāo)本滴加到硝酸纖維素膜上，病毒DNA結(jié)合到膜上，在原位進(jìn)行鹼變性處理后，有放射標(biāo)記的已知病毒DNA片段雜并，兩條單股核酸按鹼基到補(bǔ)原則結(jié)合成雙股，經(jīng)放射自顯影，陽性結(jié)果出現(xiàn)斑點(diǎn)狀雜交信號(hào)。含輪狀病毒的糞便標(biāo)本經(jīng)熱變性處理，點(diǎn)到膜上，使用輪狀病毒體外轉(zhuǎn)錄的放射標(biāo)記探針做斑點(diǎn)雜交，敏感性高于ELISA。腸道病毒也可用互補(bǔ)的DNA探針做斑點(diǎn)雜交。

　　目前核酸分子雜交不但用來檢測(cè)急性病人標(biāo)本中的病毒DNA，也用于檢測(cè)不易分離培養(yǎng)的慢性感染、潛伏感染、整合感染病人標(biāo)本中的病毒DNA。

　　2.多聚酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction, PCR) 一種體外基因擴(kuò)增法。先將待檢標(biāo)本DNA熱變性為單股DNA做為模板，加一對(duì)人工合成的與模板DNA兩端各20個(gè)鹼基互補(bǔ)的引物，在耐熱DNA多聚酶作用下，使四種脫氧核苷按模板3ˊ端引物向5ˊ端延伸DNA鏈，經(jīng)20～40個(gè)循環(huán)，可使1個(gè)拷貝的核酸擴(kuò)增至106以上，經(jīng)瓊脂糖電泳，可見到溴化乙錠染色的核酸條帶，擴(kuò)增片段的大小取決于兩引物的間距。此法較核酸雜交敏感、快速，已用于肝炎、AIDS、皰疹病毒感染診斷，尤其適用于不易分離培養(yǎng)及含量極少的病毒標(biāo)本，有較大應(yīng)用前景。

　　(二)直接檢測(cè)病毒抗原

　　1.免疫熒光(IF)技術(shù)如前所述IF可用于細(xì)胞培養(yǎng)病毒的鑒定，也適用檢測(cè)臨床標(biāo)本中病毒抗原，具有快速、特異的優(yōu)點(diǎn)。直接免疫熒光技術(shù)是用熒光素直接標(biāo)記特異性抗體，檢測(cè)病毒抗原;間接免疫熒光技術(shù)是先用特異性抗體與標(biāo)本中抗原結(jié)合，再用熒光素標(biāo)記的抗體與特異性抗體結(jié)合，從而間接識(shí)別抗原。可取咽喉脫落細(xì)胞，檢測(cè)呼吸道合胞病毒、流感及副流感病毒抗原;取病灶刮片或腦活檢標(biāo)本，檢測(cè)單純皰疹病毒抗原;取尿沉渣檢測(cè)巨細(xì)胞病毒抗原等。近年來使用單克隆抗體大大提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。

　　2.免疫酶法(IEA)原理與應(yīng)用范圍同免疫熒光技術(shù)，IEA是用酶(通常是過氧化物酶)取代熒光素標(biāo)記抗體，酶催化底物形成有色產(chǎn)物，在普通光學(xué)顯微鏡下清晰可見，不需熒光顯微鏡，便于推廣使用。

　　3.放射免疫測(cè)定法(RIA)有競(jìng)爭(zhēng)RIA和因相RNA二種方法。競(jìng)急RIA是同位素標(biāo)記的已知抗原與標(biāo)本中未標(biāo)記的待檢抗原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合特異性抗體的試驗(yàn)，將形成的復(fù)合物分離出來，用放射免疫檢測(cè)儀測(cè)定放射活性，同時(shí)與系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)抗原測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，確定出待檢抗原的濃度。因相RIA是用特異性抗體包被因相以捕獲標(biāo)本中的抗原，然后加入放射性標(biāo)記的特異性抗體與抗原結(jié)合，測(cè)定放射活性，得知抗原的量。RIA是最敏感的方法，已用于測(cè)定糞便中甲肝病毒、輪狀病毒抗原及血液中乙肝病毒抗原。

　　4.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)先將特異性抗體包被(吸附)到塑料微培板孔中以捕捉標(biāo)本中相應(yīng)抗原，然后加入酶標(biāo)特異性抗體，相應(yīng)抗原被夾在抗體之間，當(dāng)加入酶的底物后顯色，顯色程度直接反映了標(biāo)本中病毒抗原的量。因其敏感性接近RIA，又不接觸放射性物質(zhì)，已被多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用。

　　此外，對(duì)難以分離培養(yǎng)，形態(tài)特殊且病毒數(shù)量較多的標(biāo)本，可用電鏡或免疫電鏡法直接觀察，是一種快速診斷與鑒定病毒的方法，如輪狀病毒、乙肝病毒。