2016年執(zhí)業(yè)藥師《中藥化學(xué)》沖刺精華講義(4)

第五節(jié)　結(jié)構(gòu)測定

　　苷是由糖和苷元兩部分組成的。

　　苷的分解，首先了解基本的分子量的大小，就把苷通過水解的辦法變成兩部分，變成苷元部分、糖部分，然后分別對苷元部分、糖部分分別來進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究，最后將兩部分結(jié)構(gòu)，拼揍在一起，還原成一個苷的完整的結(jié)構(gòu)。

　　一、糖的鑒定

　　(一)紙色譜

　　展開劑以正丁醇-乙醇-水和水飽和的苯酚兩種系統(tǒng)應(yīng)用最為普遍。正丁醇醋酸水簡稱BAW系統(tǒng)，B代表正丁醇，A代表醋酸，W代表水。比例為4:1:5的上層溶液。糖類的紙色譜常用顯色劑有：硝酸銀試劑;三苯四氮唑鹽試劑;苯胺-鄰苯二甲酸鹽試劑;3,5-二羥基甲苯-鹽酸試劑;過碘酸加聯(lián)苯胺試劑等。

　　在用紙層吸來進(jìn)行分離，最常見的糖是葡萄糖和鼠李糖，這兩個糖Rf值的大小一般的規(guī)律是，鼠李糖因?yàn)闃O性，小于葡萄糖，在用紙色譜檢識時，鼠李糖的Rf值一般大于葡萄糖。不同的糖Rf值的大小都會有比較大的差別。

　　常用顯色劑有：硝酸銀試劑，使還原糖顯棕黑色;三苯四氮唑鹽試劑，使單糖和還原性低聚糖呈紅色;苯胺-鄰苯二甲酸鹽試劑，使單糖中的五碳糖和六碳糖所呈顏色略有區(qū)別;3，5-二羥基甲苯-鹽酸試劑，使酮糖和含酮糖的低聚糖呈紅色;過碘酸加聯(lián)苯胺，使糖、苷和多元醇中有鄰羥基結(jié)構(gòu)者呈藍(lán)底白邊。

　　(二)薄層色譜

　　糖的極性大，在硅膠薄層上進(jìn)行層析時，點(diǎn)樣量不宜過多。若點(diǎn)樣太多，斑點(diǎn)就會明顯拖尾，Rf值也下降，使一些Rf值相近的糖難以獲得滿意的分離。若硅膠用0.03mol/L硼酸溶液或一些無機(jī)鹽的水溶液代替水調(diào)制吸附劑涂鋪薄層，則樣品承載量可明顯增加，分離效果也有改善。

　　(三)氣相色譜

　　(四)離子交換色譜

　　(五)液相色譜

　　二、糖鏈的結(jié)構(gòu)測定

　　測定糖鏈的結(jié)構(gòu)主要解決三個問題：單糖的組成;糖與糖的連接位置和順序;苷鍵的構(gòu)型。

　　(一)分子量的測定　苷的分子量測定目前大多采用質(zhì)譜法。但由于其極性大導(dǎo)致熱揮發(fā)性差，電子轟擊法(EI)和化學(xué)電離(CI)常不能得到理想的結(jié)果，一般采用場解吸(FD)、快原子轟擊(FAB)、電噴霧(ESI)等方法獲得[M+H]+、[M+Na]+等準(zhǔn)分子離子峰。

　　(二)單糖的鑒定　苷中糖鏈的研究首先要了解由哪些單糖所組成，各種單糖之間的比例如何。一般是將苷鍵全部酸水解，然后用紙色譜檢出單糖的種類。經(jīng)顯色后用薄層掃描儀求得各種糖的分子比。單糖的定性定量也可以通過苷全甲基化并水解后得到的甲基化單糖的氣相色譜決定，但需要各種各樣的甲基化單糖作標(biāo)準(zhǔn)品。

　　(三)單糖之間連接位置的確定

　　單糖之間連接位置的確定的兩種方法是：苷全甲基化甲醇解，13CNMR苷化位移。

　　將苷全甲基化，然后水解苷鍵，鑒定所有獲得的甲基化單糖，其中游離的一OH的部位就是連接位置。水解要盡可能溫和，否則會發(fā)生去甲基化反應(yīng)和降解反應(yīng)。

　　(四)糖鏈連接順序的確定

　　早期決定糖連接順序的方法主要是緩和水解法，即用稀酸(包括有機(jī)酸)水解、酶解、乙酰解、堿水解等方法，將苷的糖鏈水解成較小的片段(各種低聚糖)，然后分析這些低聚糖的連接順序，從低聚糖的結(jié)構(gòu)推測整個糖鏈的結(jié)構(gòu)。Smith裂解法也廣泛用于糖連接順序的決定，只是分析碎片的工作比較繁瑣。

　　近年質(zhì)譜分析也已用于糖鏈連接順序的研究。在快原子轟擊質(zhì)譜(FABMS)中有時會出現(xiàn)苷分子中依次脫去末端糖的碎片離子峰。如果單糖的質(zhì)量不同，可由此確定糖的連接順序。

　　目前，2D-NMR和NOE差譜技術(shù)在確定糖鏈連接位置和順序的研究中有了廣泛的應(yīng)用。如在以下化合物HMBC譜中可以觀察到1″-H和7-C，1′″-H和3″-C以及l(fā)″″-H和6″′-C的遠(yuǎn)程相關(guān)，由此可判斷糖與苷元及單糖之間的連接順序。

　　(五)苷健構(gòu)型的確定

　　糖與糖之間的苷鍵和糖與非糖部分的苷鍵，本質(zhì)上都是縮醛鍵，也都存在端基碳原子的構(gòu)型問題。測定苷鍵構(gòu)型的問題主要有三種方法，即酶催化水解方法、分子旋光差法(Klyne法)和NMR法。

　　1.利用酶水解進(jìn)行測定　如麥芽糖酶能水解的為α一苷鍵，而杏仁苷酶能水解的為β一苷鍵。但必須注意并非所有的β一苷鍵都能為杏仁苷酶所水解。

　　2.利用Klyne經(jīng)驗(yàn)公式進(jìn)行計算

　　Klyne根據(jù)前人的經(jīng)驗(yàn)，得出一個計算公式，即先測定未知苷鍵構(gòu)型的苷及其水解所得苷元的旋光度，再通過計算得到其分子比旋[M]D，然后用苷的分子比旋[M]D苷減去苷元的分子比旋[M]D苷元，求得其差值為△[M]D。公式如下：

　　△[M]D=[M] D苷一[M] D苷元

　　3.利用NMR進(jìn)行測定　1HNMR：葡萄糖，β-苷鍵JH1-H2=6～8Hz，α-苷鍵JH1-H2=3～4Hz。注意鼠李糖、甘露糖不能用上法鑒別。

　　13CNMR：1JC1-H1=170Hz(α-苷鍵)，1JC1-H1=160Hz(β-苷鍵)。

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