臨床執(zhí)業(yè)醫(yī)師考試醫(yī)學(xué)免疫學(xué)：免疫PCR的原理

　　概述

　　免疫PCR主要由兩個(gè)部分組成，第一部分的免疫反應(yīng)類似于普通的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)的測(cè)定過(guò)程;第二部分即通常的PCR檢測(cè)，抗原分子的量最終由PCR產(chǎn)物的多少來(lái)反映。第一步中，首先用待測(cè)抗原(如牛血清白蛋白(ESA))包被微滴板孔，再加入相應(yīng)的特異抗體，于是抗體就與固相上的抗原結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，蛋白A-鏈親合素(Protein A-Streptavidin)嵌合體(重組融合蛋白)中的蛋白A部分可與固相上抗原抗體復(fù)合物中的抗體IgG結(jié)合，而鏈親合素部分可與生物素化的pUC19(質(zhì)粒DNA) (Biotin-pUC19)中的生物素反應(yīng)，從而將特定的DNA間接吸附于固相。接下來(lái)，就是第二步中的PCR過(guò)程，第一步中吸附于固相的pUC19質(zhì)粒DNA在相應(yīng)的引物存在下，可經(jīng)PCR在幾小時(shí)內(nèi)而放大數(shù)百萬(wàn)倍，PCR產(chǎn)物的多少與固相上抗原的量成正比。 PCR由 ①待測(cè)抗原;②生物素化抗體;③親和素(連接分子);④生物素化DNA;⑤PCR擴(kuò)增五部分構(gòu)成。

　　1、待檢抗原

　　被檢測(cè)的樣品可以是抗原，或者是作為抗原的某種抗體。待檢的抗原可以直接吸附于固相，這一過(guò)程與ELISA試驗(yàn)是相同的，因此有些吸附性差的抗原不能應(yīng)用目前介紹的免疫PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，需要對(duì)免疫PCR進(jìn)行改進(jìn)，以便能夠檢測(cè)吸附性差的抗原。免疫PCR的后續(xù)過(guò)程需PCR擴(kuò)增，目前有些方法應(yīng)用的固相板或管是特殊用于免疫PCR，并且有些PCR僅可以直接用微量板進(jìn)行擴(kuò)增，這樣可以簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)過(guò)程和提高檢測(cè)的精確性。免疫PCR具有非常高的敏感性，特別適用于檢測(cè)微量抗原。

　　2、特異抗體

　　免疫PCR中的特異抗體是對(duì)應(yīng)于待檢抗原，與ELISA一樣，抗體的特異性和親合力將影響免疫PCR的特異性和敏感性。一般均選用單克隆抗體，這個(gè)抗體常采用生物素標(biāo)記，通過(guò)親和素再結(jié)合DNA.

　　3、連接分子

　　連接分子是連接特異抗體與DNA之間的分子。目前介紹的方法中均是通過(guò)生物素與親和素系統(tǒng)使特異抗體與DNA連接，生物素和親和素作為免疫PCR的連接分子在連接方式上有許多差異。Sano首次報(bào)道PCR時(shí)用的是重組葡萄球菌A蛋白-親和素嵌合蛋白(SPA-親和素)。其具有結(jié)合IgG和生物素的兩個(gè)位點(diǎn)，因此可以將IgG與生物素化的DNA連接成復(fù)合物。由于重組的SPA-親和素沒(méi)有商品試劑，且SPA不但可以結(jié)合特異抗體的IgG，而且還可以與樣品中吸附于固相的無(wú)關(guān)IgG結(jié)合，特別是檢測(cè)的抗原就是某種IgG，因此，Ruzicke認(rèn)為Sano的免疫PCR本底高和特異性差。Ruzicke用商品化的親和素系統(tǒng)試劑建立了一種免疫PCR，這種方法是先將親和素與生物素化的DNA預(yù)結(jié)合成復(fù)合物，然后再與結(jié)合固相的特異性抗體結(jié)合，這種方法存在的問(wèn)題是親和素與生物素化的DNA分子預(yù)結(jié)合時(shí)二者的分子比例并不是等同的，一個(gè)親和素分子可以結(jié)合4個(gè)分子生物素，因此在預(yù)結(jié)合時(shí)生物素化的DNA分子不能過(guò)多，否則DNA分子上的生物素將親和素完全飽和，親和素再無(wú)結(jié)合生物素化抗體的能力;但在低飽和生物素化DNA時(shí)，親和素結(jié)合的生物素化DNA存在許多種類的復(fù)合物，甚至還有游離的親和素，只有部分結(jié)合生物素化DNA的親和素才能起到連接分子的作用，因此，這樣預(yù)結(jié)合的親和素和生物素化DNA是一均質(zhì)性很差的混合物。雖然預(yù)結(jié)合的復(fù)合物可以減少測(cè)試過(guò)程中的1次孵育和沖洗，但是這樣的復(fù)合物作為連接分子必然導(dǎo)致敏感性低和誤差大，并且每次制備的連接分子均有差異，從而導(dǎo)致重復(fù)性差。 Hong zhou等建立了一種免疫PCR方法，連接分子是鏈親和素，在連接抗體和DNA時(shí)是以游離的方式加入，這樣鏈親和素先與生物素化抗體結(jié)合，沖洗后，再加入生物素化的DNA.這個(gè)方法雖然多了1次孵育和沖洗過(guò)程，但具有較好的敏感性和重復(fù)性。

　　4、生物素化DNA

　　免疫PCR中的DNA是一指示分子，用DNA聚合酶將結(jié)合于固相上的DNA特異放大，由此定量檢測(cè)抗原。免疫PCR的敏感性高于ELISA主要是應(yīng)用了PCR強(qiáng)大的擴(kuò)增能力。免疫PCR中的DNA分子可以選擇任何DNA，但要保證DNA的純度，且有較好的均質(zhì)性，盡可能不選用受檢樣品中可能存在的DNA.一般可選用質(zhì)粒DNA或PCR產(chǎn)物等。DNA的生物素化是用生物素標(biāo)記的dATP或dUTP通過(guò)DNA聚合酶標(biāo)記在DNA分子上，一般是一個(gè)分子DNA標(biāo)記兩個(gè)生物素，標(biāo)記率可達(dá)百分之百。生物素化的DNA用量需預(yù)先選定，過(guò)多易出現(xiàn)非特異結(jié)合而引起本底過(guò)高，過(guò)低將導(dǎo)致敏感性低和出現(xiàn)不同濃度抗原得出同樣結(jié)果的飽和現(xiàn)象。

　　5、PCR系統(tǒng)

　　免疫PCR的PCR擴(kuò)增系統(tǒng)與一般PCR一樣，主要包括引物、緩沖液和耐熱DNA聚合酶。由于免疫PCR需用固相進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，同時(shí)又需要對(duì)固相結(jié)合的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，因此，免疫PCR固相的選擇應(yīng)根據(jù)具體情況確定。用微量板作為固相必須有配套的PCR儀，以使可以用微量板直接擴(kuò)增，否則需要用PCR反應(yīng)管作為固相擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)PCR產(chǎn)物的大小選擇兩種凝膠的濃度。電泳后凝膠經(jīng)染色和拍照記錄結(jié)果，再檢測(cè)底片上PCR產(chǎn)物的光密度，并與標(biāo)準(zhǔn)品比較就可以得出待檢抗原量。