2012臨床執(zhí)業(yè)醫(yī)師微生物學(xué)輔導(dǎo)：細(xì)菌感染的診斷

2012臨床執(zhí)業(yè)醫(yī)師微生物學(xué)輔導(dǎo)：細(xì)菌感染的診斷

　　一、檢測細(xì)菌或其抗原

　　(一)直接涂片顯微鏡檢查

　　自病人標(biāo)本直接涂片作染色鏡檢是簡便而快速的方法之一。自一定部位采集標(biāo)本作直接檢查需考慮細(xì)菌的形態(tài)特征與可能存在的細(xì)菌數(shù)量。腦膜炎患者的腦脊液和瘀斑刺破涂片，�？娠@示在細(xì)胞內(nèi)的革蘭氏陰性腎形雙球菌，有診斷價值。白喉患者咽部假膜涂片中可見典型的桿菌有時可有異染顆粒，也有參考診斷價值。結(jié)核患者痰直接或濃集后，涂片抗酸染色檢出結(jié)核桿菌有診斷價值。在少數(shù)情況下，也有利用免疫熒光或酶標(biāo)記抗體染色鏡檢方法進(jìn)行快速診斷，如糞例中的霍亂弧菌、痢疾桿菌等，可用這種技術(shù)檢出。

　　(二)培養(yǎng)

　　大多數(shù)病菌的形態(tài)與染色并無特征，因此需用培養(yǎng)方法來分離與鑒定細(xì)菌。雖然這一方法需要的時間較長，但比較可靠。此外，只有通過這一方法才能獲得細(xì)菌的純培養(yǎng)，可用于做藥敏試驗(yàn)或毒力試驗(yàn)。應(yīng)根據(jù)不同細(xì)菌需要的營養(yǎng)、生長條件(如厭氧或CO2)、菌落生長特征來初步識別細(xì)菌。如溶血性鏈球菌需在血瓊脂平板上生長，菌落小而透明，菌落周圍有完全溶血圈，可資鑒別。多數(shù)細(xì)菌欲確定為何種病原菌尚需進(jìn)一步獲得純培養(yǎng)及接種各種特殊培養(yǎng)基進(jìn)行生化反應(yīng)試驗(yàn)或確定其抗原性與致病力等。

　　(三)生化反應(yīng)

　　細(xì)菌的合成與分解代謝過程中，能通過酶利用一些物質(zhì)或分解一些物質(zhì)。不同的細(xì)菌具有不同的酶，因此各種細(xì)菌能夠利用與分解的物質(zhì)也各不相同。利用各種細(xì)菌的不同生化反應(yīng)幫助鑒別細(xì)菌在某些細(xì)菌如腸道桿菌中是很重要的步驟。例如腸道桿菌均為革蘭氏陰性桿菌。菌落形態(tài)亦相似，但對于糖的發(fā)酵結(jié)果不同，因此可利用不同種糖作為培養(yǎng)基質(zhì)進(jìn)行生化反應(yīng)予以區(qū)別。

　　(四)抗原檢測與分析

　　有些細(xì)菌即使用生化反應(yīng)變難區(qū)別，但其細(xì)菌抗原成份(包括菌體抗原、鞭毛抗原)卻不同。利用已知的特異抗體測定有無相應(yīng)的細(xì)菌抗原可以確定菌種或菌型。常用的方法為玻片凝集反應(yīng)，用已知的特異免疫血清與待鑒定的細(xì)菌在玻片上做凝集反應(yīng)，如出現(xiàn)凝集菌團(tuán)則為陽性，說明該菌有相應(yīng)的特異抗原。近年采用了各種檢測抗原的敏感方法，如對流免疫電泳、放射免疫、酶免疫、氣相色譜等方法，試圖直接從患者標(biāo)本中檢測細(xì)菌抗原作快速診斷。如果在細(xì)菌性腦膜炎中，利用對流免疫電泳在腦脊液中可分別檢測肺炎球菌、腦膜炎球菌及流感桿菌，特異性高，敏感性亦高。氣相色譜方法系列利用細(xì)菌代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性短鏈有機(jī)酸，進(jìn)行氣相色譜分析可鑒別細(xì)菌，這在厭氧菌中應(yīng)用很廣。檢測抗原的另一優(yōu)點(diǎn)為在應(yīng)用了抗生素治療后，細(xì)菌生長被抑制，利用培養(yǎng)方法不能檢出的細(xì)菌，因尚有抗原存在，在短期內(nèi)仍可被檢出，從而有助于明確病因。個別情況下還可利用噬菌體對細(xì)菌抗原型別分析，用于流行病學(xué)追蹤調(diào)查。

　　二、檢測抗體

　　人體受病菌感染后，經(jīng)一定時間產(chǎn)生抗體，抗體的量隨病菌感染過程而增多，表現(xiàn)為效價升高。因此用已知的細(xì)菌或抗原檢測患者體液(主要為血清)中有無相應(yīng)抗體及抗體量的動態(tài)變化，可輻助診斷。一般采用血清進(jìn)行試驗(yàn)，故又稱為血清學(xué)試驗(yàn)。血清學(xué)試驗(yàn)適用于抗原性較強(qiáng)的病原菌及病程較長的傳染病診斷。

　　正常人如已經(jīng)受過某些病原菌隱性感染或近期進(jìn)行過預(yù)防接種，血清中可能含有對該種病原菌的一定量的抗體，因此必須有抗體效價升高或隨病程遞增才有參考價值。例如傷寒患者血清抗體的檢查稱為肥達(dá)氏試驗(yàn)(Widal test，即將患者血清不同稀釋后，與傷寒、副傷寒菌抗原在試管中做凝集反應(yīng)。根據(jù)最高血清稀釋度仍有明顯凝集的血清抗體效價，結(jié)合患者具體情況作為診斷。多數(shù)血清學(xué)試驗(yàn)的診斷需取患者雙份血清，即一份在疾病的急性期，另一份在恢復(fù)期(一般為2～6周后)，當(dāng)抗體效價升高4倍以上方有診斷價值。因此血清學(xué)診斷主要為病后的回顧性診斷。但目前有利用檢測某些細(xì)菌某些細(xì)菌特lgM抗體的早期診斷方法。此外，在檢測測抗體時至少應(yīng)有懷疑可能致病細(xì)菌的線索方可采用相應(yīng)抗原，否則就無從選擇做何種血清學(xué)試驗(yàn)。有些患者因早期使用抗生素治療，細(xì)菌在體內(nèi)繁殖不多，患者可不產(chǎn)生抗體，因而并非每一患者均有抗體效價升高的表現(xiàn)。然而當(dāng)病原菌未能被檢出時，有些患者仍可通過血清抗本效價的升高予以診斷，因此檢測細(xì)菌是互相輔助的診斷方法。

　　三、檢測細(xì)菌遺傳物質(zhì)

　　通過檢測病原體遺傳物質(zhì)來確認(rèn)病原體也許是檢查病原體為直接的方法了。目前比較成熟的技術(shù)包括基因探針技術(shù)和PCR技術(shù)。

　　(一)基因探針技術(shù)

　　用標(biāo)記物標(biāo)記細(xì)菌染色體或質(zhì)粒DNA上的特異性片段制備成細(xì)菌探針，待檢標(biāo)本經(jīng)過短時間培養(yǎng)后，經(jīng)過點(diǎn)膜、裂解變性、預(yù)雜交和雜交后，利用探針上標(biāo)記物發(fā)出的信號可以知道雜交結(jié)果并判斷病原體的性質(zhì)。基因探針技術(shù)操作比較復(fù)雜，加之同位素污染等問題，目前尚不能普及應(yīng)用。近年來發(fā)展起來的地高辛標(biāo)記的非同位素探針，從探針標(biāo)記到雜交都很方便，只是價格昂貴，仍限于科研應(yīng)用，尚不能普及。

　　(二)PCR技術(shù)

　　這是八十年代末發(fā)展起來的一項(xiàng)極有應(yīng)用價值的技術(shù)，設(shè)計(jì)病原體基因的特異引物，細(xì)菌標(biāo)本(不經(jīng)培養(yǎng))經(jīng)過簡單裂解、變性后，就可在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，經(jīng)過25～30個循環(huán)，通過瓊脂糖電泳即可觀察擴(kuò)增結(jié)果，檢出病原體。這種技術(shù)的特點(diǎn)是簡便、快速。它尤其適于那些培養(yǎng)時間較長的病原菌的檢查，如結(jié)核桿菌、支原體等。PCR高度的敏感性使該技術(shù)在病原體診斷過程中極易出現(xiàn)假陽性，避免污染是提高PCR診斷準(zhǔn)確性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

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