2016年執(zhí)業(yè)藥師《藥物分析》考試預(yù)習(xí)資料（30）

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　　酶的提取

　　胞外酶可以直接進行提取分離;胞內(nèi)游離存在的“離酶”以及與顆粒體(如細(xì)胞核、線粒體、微粒體、質(zhì)膜)結(jié)合的“結(jié)酶”都有一個破碎細(xì)胞過程，“結(jié)酶”還有一個轉(zhuǎn)變成水溶液的問題。因此對酶類的提取要采用多種方法，常用的細(xì)胞破碎法如下：

　　機械法：如絞碎、刨碎、勻漿、研磨、擠壓或超聲波等。研磨時還可加入細(xì)砂、石英粉、氧化鋁等以利細(xì)胞破碎。

　　化學(xué)法：用鹽、堿、表面活性劑、EDTA、丙酮和正丁醇等可使細(xì)胞破碎、顆粒體結(jié)構(gòu)解體，從而把酶釋放出來。例如常將胰臟用數(shù)倍量丙酮處理2～3次，制成丙酮粉供多種酶的提取用;用膽酸鹽處理膜結(jié)構(gòu)上的脂蛋白和“結(jié)酶”，使兩者形成復(fù)合物，并帶上靜電荷，由于電荷之間的排斥作用，使膜破裂，達到溶解。

　　酶解法：用組織自溶或用溶菌酶、脫氧核糖核酸酶、磷脂酶等降解細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，然后再進行提取。但應(yīng)知道組織自溶法對某些酶的提取是不利的，如胰蛋白是以酶原形式純化后再激活成胰蛋白酶的，若用自溶法提取，酶原已轉(zhuǎn)成酶，純化就很困難。而用純的工具酶降解法是無此缺點，但成本較高。

　　凍融法：采用反復(fù)冷凍與融化時由于細(xì)胞中形成了冰晶及剩余液體中鹽濃度的增高可以使細(xì)胞破裂。

　　酶的提取溶劑可以用水、一定濃度的乙醇、乙二醇、丁醇和稀鹽溶液、緩沖溶液等;也可以用稀堿或稀酸溶液，如用稀硫酸提取胰蛋白酶，用稀鹽酸提取胃蛋白酶。溶劑用量一般為原料重量的1～5倍。攪拌可加速提取，但轉(zhuǎn)速不宜太快，否則會產(chǎn)生泡沫而難以過濾或使酶變性。多數(shù)酶的提取要在50C以下操作，但有的酶在較高溫度下提取更好，如胃蛋白酶在450C提得收率較高，一般可在一5～+400C間適當(dāng)選擇。提取液的pH應(yīng)在酶的穩(wěn)定pH范圍內(nèi)，并應(yīng)遠離其等電點的pH為宜，如蛋白酶選用pH2.5～3，0，胰蛋白酶和α一糜蛋白酶則用0.25 N硫酸提取。若在中性或堿性提取時，最常用的是0.15 mol/L氯化鈉、0.02～0.05mol/L磷酸緩沖液、0.02-0.05mol/L焦磷酸緩沖液。正丁醇的親脂性強，能透入酶的脂質(zhì)結(jié)合物中，又兼有親水性，有類似表面活性劑的作用，適用于提取“結(jié)酶”。

　　為了減少提取液體積，可用多段逆流提取或柱型抽提法。液渣分離可用過濾法(如板框壓濾、旋轉(zhuǎn)真空過濾)或離心法。過濾時可加硅藻土、紙漿等為助濾劑。離心時可加入氫氧化鋁凝膠、磷酸鈣凝膠等以除去懸浮的膠體物質(zhì)。

　　雜質(zhì)的去除

　　酶提取液中常含有雜蛋白、多糖、脂類及核酸等雜質(zhì)，可用下述方法去除：

　　調(diào)PH和加熱法：利用蛋白質(zhì)對酸、堿和熱變性方面性質(zhì)的差異，可去除非活性雜蛋白。如制備脂肪酶時，在pH3、4時以400C溫度加熱150 min，淀粉酶活力可喪失90%而被除去，而脂肪酶活力仍保持80%以上。

　　蛋白質(zhì)表面變性法：蛋白質(zhì)表面變性后其性質(zhì)有所不同，借以去除雜蛋白。如制備過氧化氫酶時，加入氯仿和乙醇進行振蕩可以將雜蛋白變性而去除。

　　蛋白質(zhì)沉淀劑法：利用醋酸鋁、利凡諾、單寧酸、離子型表 面活性劑等蛋白質(zhì)沉淀劑可以去除雜蛋白及粘多糖類雜質(zhì)。使用時要注意這類試劑�？梢鹈缸冃允Щ睿虼藨�(yīng)迅速除去。

　　選擇性變性法：各種蛋白質(zhì)對變性劑的穩(wěn)定性不同，可以用選擇性變性劑去除雜蛋白。如細(xì)胞色素丙對三氯醋酸較穩(wěn)定，所以在制備時可用2.5%三氯醋酸使其他雜蛋白變性使沉淀除去。

　　加保護劑熱變性法：酶與底物或競爭性抑制劑結(jié)合后，其穩(wěn)定性常顯著增加。所以常用它們?yōu)楸Ｗo劑，再用一些劇烈手段破壞雜蛋白，如用D-甲基苯甲酸為D-氨基酸氧化酶的保護劑，經(jīng)加熱除去雜蛋白，使該酶得到很好的提純。

　　核酸沉淀劑法：酶液中的核酸類雜質(zhì)，可以用氯化錳、魚精蛋白硫酸鹽等沉淀劑使其沉淀而除去。必要時，也可用核糖核酶將核酸降解后除去。

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