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第六章 色譜法
色譜的概念與分析特點(diǎn)
色譜理論
色譜分類(lèi)
色譜儀器基本結(jié)構(gòu)(檢測(cè)器)
色譜分析應(yīng)用
色譜基礎(chǔ)知識(shí)
1.色譜分析特點(diǎn)：高靈敏度、高效能、高選擇性、快速度
2.色譜峰三參數(shù)：峰面積(定量)、峰位(定性)、峰寬(柱效)
色譜理論
分配系數(shù)、容量因子：k=K×(Vs/Vm)=(Cs/Cm)×(Vs/Vm) ;容量因子差異是色譜分離的先決條件;分配系數(shù)差異是物質(zhì)分離的前提。
兩個(gè)理論
速率理論：渦流擴(kuò)散(小粒度均勻顆粒勻漿裝柱);傳質(zhì)阻抗(小粒度、低粘度、適當(dāng)高溫);縱向擴(kuò)散(限氣相色譜)
塔板理論：n=5.54(tR/Wh/2)2
H=L/n
色譜分離原理分類(lèi)
吸附色譜：如薄層色譜
分配色譜：固定相為液體的液相、氣相色譜，最普遍
離子交換色譜：離子型物質(zhì)分離
分子排阻色譜：大分子物質(zhì)可利用分子大小不同而分離
薄層色譜
原理：利用A、B兩種物質(zhì)的KA≠KB而分離
固定相：硅膠(活化、G、H、F254)、硅藻土、氧化鋁、纖維素等
薄層板制備：1份固定相+3份水，同一方向研磨
點(diǎn)樣：距底邊2.0cm，樣點(diǎn)直徑2-4mm;
檢視：顯色、熒光
色譜系統(tǒng)適用性：靈敏度、比移值、分離度
應(yīng)用
鑒別：比較Rf值是否一致
雜質(zhì)檢查：雜質(zhì)對(duì)照法、自身稀釋對(duì)照法
高效液相色譜法
原理：分配色譜、分子排阻色譜、離子交換…
分配色譜分類(lèi)：
反相色譜(流動(dòng)相極性大于固定相;極性強(qiáng)的先出柱;分離非極性和中等極性有機(jī)分子;固定相多為C18(ODS)和C8柱;流動(dòng)相多為甲醇-水或乙腈-水;最廣泛);
正相色譜(流動(dòng)相極性小于固定相;極性弱的先出柱;分離極性和中等極性有機(jī)分子)
儀器結(jié)構(gòu)
高壓泵
色譜柱(固定相：C18烷基鍵合硅膠，流動(dòng)相：甲醇-水或乙腈-水)
進(jìn)樣閥
檢測(cè)器
濃度型：紫外檢測(cè)器、光電二極管陣列檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器、質(zhì)譜檢測(cè)器
質(zhì)量型：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器
色譜系統(tǒng)適用性
四參數(shù)：理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因子
理論板數(shù)、分離度(R>1.5)、重復(fù)性(RSD≤2.0%)、拖尾因子(0.95-1.05)的計(jì)算公式
標(biāo)準(zhǔn)色譜分析方法中的固定因素：固定相種類(lèi)、流動(dòng)相組成、檢測(cè)器類(lèi)型
應(yīng)用
1.鑒別：比較tR
2.雜質(zhì)檢查
內(nèi)標(biāo)法(公式)
外標(biāo)法(公式)
加校正因子(需有雜質(zhì)對(duì)照品)和不加校正因子主成分自身對(duì)照
面積歸一化
3.含量測(cè)定
內(nèi)標(biāo)法
外標(biāo)法
氣相色譜法
原理：分配色譜，分離熱穩(wěn)定蒸汽壓大的物質(zhì)
儀器結(jié)構(gòu)
氣源：氮、氦、氫
進(jìn)樣：頂空進(jìn)樣、直接進(jìn)樣
色譜柱：填充柱和毛細(xì)管柱(開(kāi)管型(涂壁WCOT或涂層SCOT);填充型);SCOT應(yīng)用最多;色譜柱用前需老化
固定液與載體
固定液：烴類(lèi)(角鯊?fù)椋菢O性)、硅氧烷(弱極性，應(yīng)用最廣)、醇類(lèi)(氫鍵型，聚乙二醇，藥物分析常用)
載體：硅藻土、多孔微球
檢測(cè)器：火焰離子化檢測(cè)器(FID)、電子捕獲檢測(cè)器(ECD，用于含鹵素、硫、氧、等電負(fù)性強(qiáng)基團(tuán))、質(zhì)譜檢測(cè)器(MS)、熱導(dǎo)檢測(cè)器(TCD)
應(yīng)用(同液相色譜)
內(nèi)標(biāo)法
外標(biāo)法
標(biāo)準(zhǔn)加入法(消除樣本基質(zhì)的影響)
面積歸一化法
電泳法
原理：帶電荷物質(zhì)在電場(chǎng)下趟度差異而分離
影響因素：pH值和離子強(qiáng)度(緩沖液)、電場(chǎng)強(qiáng)度、樣品濃度1%
類(lèi)型：平板電泳、毛細(xì)管電泳
應(yīng)用
鑒別：肝素鈉乳膏鑒別：瓊脂糖凝膠電泳
分子量測(cè)定：注射用重組人促紅素:SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳
純度檢查：凍干人血白蛋白純度：醋酸纖維素薄膜電泳;肉毒抗毒素純度：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳
等電點(diǎn)測(cè)定：注射用重組人白介素-2等電點(diǎn)：等電聚膠電泳
分子組分比測(cè)定：尿激酶分子組分比：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳
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