第六章 色譜法
色譜法是一種物理或物理化學(xué)分離分析方法。先將混合物中各組分分離而后逐個(gè)分析,是分析化合物有力手段。具有高靈敏度、高選擇性、高效能、分析速度快、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。
第一節(jié) 概論
一、基本原理
色譜過程是物質(zhì)分子在相對(duì)運(yùn)動(dòng)的兩相(固定相和流動(dòng)相)間分配平衡的過程,可用分配系數(shù)K和容量因子k描述。
1.分配系數(shù)K=Cs/Cm,與組分、固定相和流動(dòng)相性質(zhì)和溫度有關(guān)。
2.容量因子k=Ws/Wm,不僅與組分、固定相和流動(dòng)相性質(zhì)和溫度有關(guān),還與兩相體積有關(guān)。容量因子不等是色譜分離的先決條件。
3.色譜過程方程:保留時(shí)間與分配系數(shù)關(guān)系tR=t0(1+k)
二、分類
1.按分離原理
(1) 吸附色譜法:固定相為固體
(2) 分配色譜法:固定相為液體
(3) 離子交換色譜法:固定相為離子交換樹脂
(4) 分子排阻色譜法:固定相為多孔填料
2.按操作形式:平面色譜、柱色譜、電泳法
3.按兩相物態(tài):氣相色譜、液相色譜
第二節(jié) 薄層色譜法
一、基本原理
吸附劑對(duì)不同組分A和B具有不同吸附能力,展開劑也對(duì)A和B有不同溶解、解吸能力,當(dāng)展開劑不斷展開,A、B在吸附劑和展開劑之間連續(xù)不斷吸附解吸,產(chǎn)生差速遷移得到分離。
二、固定相
1.硅膠:含水量越高,活性越低,吸附力越弱。在105~110℃加熱30min,使其活化。硅膠G、硅膠H、硅膠GF254、硅膠HF254的含義
2.氧化鋁:堿性、中性和酸性三種;钚耘c含水量有關(guān)
3.聚酰胺:可與酚羥基、羧基、氨基酸形成氫鍵,選擇性高
三、操作方法
1.制備:1份固定相與3份水混和涂布,110℃烘30分鐘
2.點(diǎn)樣與展開:點(diǎn)樣一般為直徑2~4mm圓點(diǎn),距底2.0cm;展開距離一般為10~15cm。
3.檢視:熒光板在紫外光下檢視;普通薄層板用物理方法或顯色劑顯色。
4.系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
比移值:Rf=l/l0,為組分遷移距離與展開劑遷移距離之比
比移值的最佳范圍是0.3~0.5,可用范圍是0.2~0.8。
影響比移值因素:①被分離物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。極性較強(qiáng)的組分Rf較小。②薄層板性質(zhì)。吸附劑活性越強(qiáng),Rf較小。③展開劑性質(zhì)。極性越強(qiáng)展開劑Rf值增大④展開劑蒸氣飽和程度。
3.分離度:R=2d/(W1+W2),兩相鄰斑點(diǎn)中心距離與兩斑點(diǎn)平均寬度的比值
四、應(yīng)用
1.鑒別:比較供試品與對(duì)照品溶液的比移值
2.雜質(zhì)檢查:雜質(zhì)對(duì)照品比較法;自身稀釋對(duì)照法
第三節(jié) 高效液相色譜法
一、基本原理
1.基本概念
色譜峰參數(shù):峰高或峰面積(用于定量),峰位(保留值表示,用于定性),峰寬(用于衡量柱效)
保留值:保留時(shí)間、死時(shí)間、調(diào)整保留時(shí)間
峰寬:標(biāo)準(zhǔn)差、半峰寬、峰寬
2.塔板理論:把組分在兩相間的連續(xù)轉(zhuǎn)移過程,分解為間歇的在單個(gè)塔板中的分配平衡過程
理論塔板數(shù) n=5.54(tR/Wh/2)2
色譜柱的理論塔板數(shù)越多,柱效越高;同樣長(zhǎng)度中塔板高度越小,柱效越高。
3.速率理論:主要說明使色譜峰擴(kuò)張而降低柱效的因素
范氏方程 H=A+B/μ+Cμ
A為渦流擴(kuò)散項(xiàng)。采用適當(dāng)粒度、均勻的填料并填充均勻可減小渦流擴(kuò)散
B為縱向擴(kuò)散系數(shù)。流動(dòng)相為液體,柱溫為室溫,B/μ可忽略不計(jì)
C為傳質(zhì)阻抗系數(shù)。在能完全覆蓋載體表面的前提下,應(yīng)適當(dāng)減少固定液用量。
二、高效液相色譜儀
1.高壓輸液泵
2.色譜柱:分析型和制備型
3.進(jìn)樣閥
4.檢測(cè)器
(1)選擇性檢測(cè)器:與待測(cè)物濃度、結(jié)構(gòu)有關(guān)
、僮贤鈾z測(cè)器:靈敏度、重復(fù)性及線性范圍較好,適用于具有共軛結(jié)構(gòu)的化合物的檢測(cè)
、诠舛䴓O管陣列檢測(cè)器:檢測(cè)原理相同,可同時(shí)記錄待測(cè)物吸收光譜,用于光譜鑒定和純度檢查
③熒光檢測(cè)器:靈敏,用于在流動(dòng)相條件下具有熒光或經(jīng)衍生轉(zhuǎn)化為具有熒光的化合物的檢測(cè)
、茈娀瘜W(xué)檢測(cè)器:靈敏度高,僅用于在流動(dòng)相條件下發(fā)生氧化-還原反應(yīng)的化合物
⑤質(zhì)譜檢測(cè)器:高靈敏度、高選擇性、分析范圍廣;不適用于小分子化合物,主要用于大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、多肽的檢測(cè)
。2)通用性檢測(cè)器:質(zhì)量型檢測(cè)器
、偈静钫酃鈾z測(cè)器:僅對(duì)少數(shù)物質(zhì)如糖類靈敏度較高,受環(huán)境溫度影響大,實(shí)際應(yīng)用少
、谡舭l(fā)光散射檢測(cè)器:適用于UV檢測(cè)困難的物質(zhì)的分析,響應(yīng)值與濃度通常不呈線性關(guān)系。
三、吸附色譜法
1.原理:被分離組分與流動(dòng)相對(duì)吸附劑吸附能力的差異
2.常用固定相和流動(dòng)相
固定相:硅膠、氧化鋁、高分子多孔微
流動(dòng)相:烷烴加極性調(diào)節(jié)劑;極性越強(qiáng),洗脫能力越強(qiáng)
四、分配色譜法
1.原理:被分離組分溶入互不相溶的固定相與流動(dòng)相,達(dá)到平衡后濃度之比(分配系數(shù))的差異
正相分配色譜:流動(dòng)相極性小于固定相極性。極性小的組分先流出,極性大的組分后流出。用于分離極性及中等極性物質(zhì)
反相分配色譜:流動(dòng)相極性大于固定相極性。極性大的組分先流出,極性小的組分后流出。應(yīng)用廣泛,用于分離非極性至中等極性物質(zhì)
離子對(duì)反相色譜:在流動(dòng)相中加入有機(jī)離子對(duì)試劑,用于有機(jī)酸、堿、鹽的分離
離子抑制色譜:調(diào)整流動(dòng)相pH,抑制組分的解離
2.常用固定相和流動(dòng)相
。1)固定相:化學(xué)鍵合相
非極性:十八烷基硅烷鍵合硅膠
極性:氨基和氰基硅烷鍵合相
(2)流動(dòng)相
正相色譜:烷烴加極性調(diào)節(jié)劑
反相色譜:甲醇-水、乙腈-水
五、色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
固定相種類、流動(dòng)相組成、檢測(cè)器類型不得改變,其余可適當(dāng)改變以達(dá)到色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求
1.理論塔板數(shù):不得低于各品種項(xiàng)下規(guī)定的最小理論塔板數(shù)
2.分離度:除另有規(guī)定外,分離度應(yīng)大于1.5
3.重復(fù)性:取各品種項(xiàng)下對(duì)照品2連續(xù)進(jìn)樣5次,除另有規(guī)定外,其峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于2.0%
4.拖尾因子:除另有規(guī)定外,拖尾因子應(yīng)在0.95~1.05之間
六、應(yīng)用
1.鑒別:利用保留值進(jìn)行鑒別。
2.檢查
(1) 內(nèi)標(biāo)法加校正因子測(cè)定供試品中某個(gè)雜質(zhì)含量
(2) 外標(biāo)法測(cè)定供試品中某個(gè)雜質(zhì)含量
(3) 加校正因子的主成分自身對(duì)照法
(4) 不加校正因子的主成分自身對(duì)照法
(5) 面積歸一化法:一般不用于微量雜質(zhì)檢查
3.含量測(cè)定:外標(biāo)法,內(nèi)標(biāo)法
內(nèi)標(biāo)物要求:①原樣品中不含有的組分;②保留時(shí)間與待測(cè)組分相近,但能完全分離;③純度合乎要求。
第四節(jié) 氣相色譜法
一、基本原理
以氣體為流動(dòng)相的色譜法,具有分離效能高、靈敏度高、樣品用量少、分析速度快等優(yōu)點(diǎn),不適用于難揮發(fā)和熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)分析。
分類:吸附色譜和分配色譜;氣-固色譜和氣-液色譜;填充柱色譜和毛細(xì)管色譜
二、氣相色譜儀
1.氣源:FID常用載氣多為氮?dú)饣蚝;TCD多用氦氣或氫氣為載氣;ECD多用氮?dú)饣驓鍤?BR> 2.進(jìn)樣方式:溶液直接進(jìn)樣;頂空進(jìn)樣
3.色譜柱和柱溫箱:填充柱和毛細(xì)管柱
4.檢測(cè)器
火焰離子化檢測(cè)器FID:靈敏度高、響應(yīng)快、線性范圍寬,最常用。
氮磷檢測(cè)器NPD:適用于含氮、磷元素的藥物
火焰光度檢測(cè)器FPD:適用于含磷、硫元素的藥物
電子捕獲檢測(cè)器ECD:主要用于含鹵素的藥物
質(zhì)譜檢測(cè)器MS:高靈敏度、高專屬性,可用于結(jié)構(gòu)確證
熱導(dǎo)檢測(cè)器TCD:構(gòu)造簡(jiǎn)單、測(cè)定范圍廣、樣品不破壞,但靈敏度較低。
三、常用固定液與載體
1.固定液
烴類:標(biāo)準(zhǔn)非極性固定液
硅氧烷類:通用型固定液
醇類:氫鍵型固定液
2.載體:化學(xué)惰性的多孔微粒,常用硅藻土
3.毛細(xì)管色譜柱
開管型:涂壁毛細(xì)管柱、載體涂層毛細(xì)管柱
填充型
四、色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)
檢測(cè)器種類、固定液品種及特殊指定的色譜材料不得改變。
五、應(yīng)用
標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法:配制雜質(zhì)對(duì)照品溶液,精密加入到供試品中,測(cè)定雜質(zhì)含量,再扣除加入對(duì)照品溶液量。
采用頂空進(jìn)樣時(shí),該法可消除基質(zhì)效應(yīng)的影響。該法與其他方法結(jié)果不一致時(shí)以本法結(jié)果為準(zhǔn)。
第五節(jié) 電泳法
一、基本原理
電泳遷移速度 ν=μE
在相同電場(chǎng)強(qiáng)度下,兩組分分離程度取決于二者淌度之差。電泳分離后各組分的相對(duì)位置由組分的電泳泳動(dòng)和緩沖液電滲共同決定。
影響電泳分離的條件包括:
1.緩沖液的pH值和離子強(qiáng)度:pH直接影響組分的荷電情況,是電泳分離的最重要條件。離子強(qiáng)度太小則緩沖容量不足,區(qū)帶易擴(kuò)散;太大則組分移動(dòng)慢,發(fā)熱嚴(yán)重。
2.電場(chǎng)強(qiáng)度:電場(chǎng)強(qiáng)度越大分離越完全,大于20V/cm時(shí)發(fā)熱嚴(yán)重。
3.樣品濃度:通常以1%為宜。太濃拖尾,太稀測(cè)定結(jié)構(gòu)精密度差。
二、各類電泳法
1.紙電泳法
2.醋酸纖維素電泳法
3.瓊酯糖凝膠電泳法
4.聚丙烯酰胺凝膠電泳法
5.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法
三、毛細(xì)管電泳法
以彈性石英毛細(xì)管為分離通道,以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力,依照樣品中各組分之間淌度和分配行為的差異而實(shí)現(xiàn)分離的方法。
1.毛細(xì)管區(qū)帶電泳
2.毛細(xì)管凝膠電泳
3.毛細(xì)管等速電泳
4.毛細(xì)管等電聚焦電泳
5.膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜
6.毛細(xì)管電色譜
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