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HLA分型技術(shù)
HLA分型并不只是一種應(yīng)用性的臨床檢測(cè)指標(biāo)，免疫遺傳學(xué)研究的發(fā)展，很大程度上依賴于以分型為主要手段的HLA多態(tài)性分析。60年代建立的并不斷完善的血清學(xué)及細(xì)胞學(xué)分型技術(shù)主要側(cè)重于分析HLA產(chǎn)物特異性;80年代起建立的DNA分型方法則側(cè)重于基因的分型。
一、血清學(xué)分型技術(shù)
(一)HLA-Ⅰ類抗原的檢測(cè)
HLA-A、B、C抗原型別鑒定均借助微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)(microlymphocytotoxicitytest)或稱補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒試驗(yàn)(complement dependent cytotoxicitytest)。原理為取已知HLA抗血清加入待測(cè)外周血淋巴細(xì)胞，作用后加入免補(bǔ)體，充分作用后加入染料，在倒置顯微鏡下判斷結(jié)果，著染的細(xì)胞為死亡細(xì)胞，表示待檢淋巴細(xì)胞表面具有已知抗血清所針對(duì)的抗原。標(biāo)準(zhǔn)抗原清取自多次經(jīng)產(chǎn)婦或計(jì)劃免疫志愿者。
(二)HLA-DR、DQ抗原檢測(cè)
該二抗原分型方法同HLA-Ⅰ類抗原，但所用抗血清須經(jīng)過血小板吸收以去除針對(duì)Ⅰ類抗原的抗體。另外，待測(cè)細(xì)胞須是經(jīng)純化的B細(xì)胞。
血清學(xué)分型是一項(xiàng)古老的技術(shù)，雖然近年來已建立許多新的分型技術(shù)，但血清學(xué)方法目前仍是HLA分型的基礎(chǔ)。
二、細(xì)胞學(xué)分型技術(shù)
HLA-Dw特異性與HLA-DP特異性可分別通過純合分型細(xì)胞(homozygote typing cell,HTC)及預(yù)致敏淋巴細(xì)胞試驗(yàn)(primed lymphocyte test,PLT)檢測(cè)。二種方法的基本原理均是判斷淋巴細(xì)胞在識(shí)別非已HLA抗原決定簇后發(fā)生的增殖反應(yīng)。由于分型細(xì)胞來源困難以及操作手續(xù)繁瑣，細(xì)胞學(xué)分型技術(shù)下正逐漸淘汰。
三、HLA的DNA分型技術(shù)
上述傳統(tǒng)的HLA分型方法有許多不足之處，近年來國(guó)內(nèi)外已將HLA分型技術(shù)由抗原水平發(fā)展到基因水平。
(一)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性檢測(cè)技術(shù)
這是首先建立的對(duì)多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)的DNA分析技術(shù)。個(gè)體間抗原特異性來自氨基酸順序的差別，后者由編碼基因的堿基順序不同所決定。這種堿基順序的差別造成限制性內(nèi)切酶識(shí)位置及酶切位點(diǎn)數(shù)目的不同，從而產(chǎn)生數(shù)量和長(zhǎng)度不一的DNA酶切片段。用特異性探針對(duì)整個(gè)基因組DNA酶切片段進(jìn)行雜交，即可分析限制性長(zhǎng)度片段多態(tài)性(restriction fragment lengthpolymorphism,RFLP)。一定的內(nèi)切酶組合所得到的HLA-RFLP可以和傳統(tǒng)方法測(cè)定的HLA特異性型別相關(guān)。80年代末發(fā)展起來的PCR(polymerase chain reaction)技術(shù)已被用于RFLP分析，即用等位特異限制酶裂解PCR擴(kuò)增的片段，然后再進(jìn)行分析，從而大提高了靈敏度。
(二)PCR/SSO技術(shù)
此法乃用人工合成的HLA型別特異的寡核苷酸序列作為探針，與待檢細(xì)胞經(jīng)PCR擴(kuò)增的HLA基因片段雜交，從而確定HLA型別，PCR技術(shù)可將HLA復(fù)合體上指定基因片段特異性地?cái)U(kuò)增5～6個(gè)數(shù)量級(jí);而專門設(shè)計(jì)的SSO(序列特異的寡核苷酸sequencedpecific oligonucleotide)探針又能探測(cè)出等位基因間1～2個(gè)核苷酸的差異，故PCR/SSO技術(shù)具有靈敏度、特異性強(qiáng)、需樣本量少等優(yōu)點(diǎn)。
(三)PCR/SSP技術(shù)
目前常規(guī)的HLA-DNA分型技術(shù)，包括上述的PCR/RFLP、PCR/SSO等，最終均需用標(biāo)記的特性探針與擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交，再分析結(jié)果。PCR/SSP方法用乃設(shè)計(jì)出一整套等位基因組特異性引物(sequence specific primer,SSP)，借助PCR技術(shù)獲得HLA型別特異的擴(kuò)增產(chǎn)物，可通過電泳直接分析帶型決定HLA型別，從而大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟。
由于傳統(tǒng)方法在Ⅱ類抗原分型方面困難較大，故上述幾種基因分析型方法目前主要用于Ⅱ類基因座。此外，目前已建立的HLA基因分型技術(shù)還包括PCR單鏈構(gòu)像多態(tài)性分析(PCR-single strand conformational polymorphism，PCR-SSCP)和PCR 異源二聚體電泳多態(tài)即PCR指紋圖(PCr fingerprinting)分析。DNA分型技術(shù)的應(yīng)用，使HLA型別分析達(dá)到了更精細(xì)的水平，并因此發(fā)現(xiàn)了更多的HLA多態(tài)性。HLA的DNA分型技術(shù)現(xiàn)已成為血清學(xué)方法的競(jìng)爭(zhēng)者，并可能在不久的將來完全取而代之。
HLA是目前所知人體最復(fù)雜的遺傳多態(tài)性系統(tǒng)。HLA研究涉及免疫學(xué)、生物學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等多個(gè)學(xué)科，并已發(fā)展成為一個(gè)獨(dú)立的學(xué)科分支。迄今HLA研究已達(dá)到相當(dāng)深入的水平，并在諸多方面取得顯著進(jìn)展，包括HLA復(fù)合體結(jié)構(gòu);HLA分子結(jié)構(gòu)及其表達(dá)的調(diào)控;HLA分子功能，尤其是在抗原處理、呈遞及T細(xì)胞識(shí)別中的作用;HLA的DNA分型及多態(tài)性研究;HLA與疾病的關(guān)系;HLA與移植的關(guān)系等。HLA研究不僅使器官移植成為一種極有價(jià)值的治療手段，并給基礎(chǔ)與臨床免疫帶來了突破性進(jìn)展。已經(jīng)證實(shí)，HLA復(fù)合體中存在控制免疫應(yīng)答的基因以及HLA參與約束免疫細(xì)胞間相互作用，這表示HLA涉及生命活動(dòng)的各個(gè)水平與多個(gè)方面�？梢灶A(yù)期，對(duì)HLA的研究將繼續(xù)成為免疫遺傳學(xué)最活躍的部分;對(duì)HLA的應(yīng)用將擴(kuò)展到基礎(chǔ)、臨床、預(yù)防醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。
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